一：基因毒性杂质（GTI）相关指导原则

目前，ICH成员国如美国、欧盟、中国均以ICH  M7（R1）为最新核心指导文件。

ICH：M7（R1）Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals To Limit Potential Carcinogenic Risk,2018.03

ICH：S2（R1）Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use, 2012

EMA：Guideline of the limits of genotoxic mpuritie,2006

FDA：Guidance for Industry, Genotoxic and carcinogenic impurities in Drug Substances and Drug Products: Recommended Approaches,Draft,2008

NMPA：药物遗传毒性研究技术指导原则，2018.03

二：基因毒性杂质（GTI）研究思路

识别GTI→进行危害性评估、风险表征→制定研究策略制定限度→建立分析方法进行控制。

1、识别GTI

识别GTI需要从概念和原理出发。GTI关注较低水平即可造成DNA损伤、突变、可能引发癌症的DNA活性物质。那么，DNA的结构你还记得吗？核糖或脱氧核糖中C1上的半缩醛羟基（β-构型）与嘌呤碱基上的N9-H或嘧啶碱基上的N1-H脱水连接而成核苷；核苷再被磷酸酯化（脱氧核糖中5’位和核糖中5’位上的羟基被磷酸酯化）后，形成作为DNA或RNA基本结构的核苷酸。核苷酸碱基上的氮、氧，磷酸酯骨架富有电子，容易与缺电子的试剂发生取代等反应。而GTI就是亲电试剂或者可以代谢成亲电试剂，然后和DNA的亲核基团发生反应。我们可以从公开的毒理学数据库ToxNet 、CCRIS、CPDB、DSSTox等进行搜索，也可以根据汇总的GTI结构特征进行判断、推理^[1,2]。

本文先从亚硝基芳香化合物、硝基芳香化合物、芳胺着手，和大家一起探讨、研究该类物质的结构特征。

上图中：

1 为亚硝基芳香化合物；

2 为硝基取代芳香化合物；

3 为一级芳胺；

4、5 为能生成芳胺的基团；

6、7 为芳基取代的羟胺及其衍生酯；

含氮芳香环（指含有芳香胺、硝基、亚硝基或羟胺基团的化合物）在体内P450酶的作用下先形成N-羟基胺，再与DNA反应，产生毒副作用。

经文献检索，含有这类基因毒杂的部分药物较多，举例如下（见表1）：

表1 含有亚硝基芳香化合物、硝基芳香化合物、芳胺的药物

2、进行危害性评估、风险表征

参考ICH M7(R1)“6.危害性评估”、“7.风险表征”。

3、制定研究策略

据M7（R1）“8.控制”所述，构建适当的控制策略的基础是要全面理解原料药生产工艺相关的化学信息、制剂生产工艺以及原料药和制剂的整体稳定性。实际工作中，多数研究、控制工作集中在原料药部分，因而“8.1 工艺相关杂质的控制”项下开发原料药控制策略的4种方法尤其重要（表2）。   

表2 原料药中GTI控制策略（4种可能的方法）

4、制定限度

在进行危害性评估、风险表征基础上详细制定杂质限度，可接受摄入量AI的计算方法有：

（1）标准方法，即基于线性作用方式进行AI计算；

（2）其他算法，即主要是考虑人类肿瘤相关性及公布的法规限度的具体情况来制定；

（3）非线性（阈值）的作用方式来进行PDE的计算。

5、建立分析方法进行控制

根据起始原料、中间体、原料药的物理特性（如溶解性、沸点）、化学活性，待测杂质的极性、挥发性、结构特征，以及检测器极限等主要因素来选择合适的分析方法。可以借鉴的决策思路如下图。

分析方法决策思路示例图

对于亚硝基芳香化合物、硝基芳香化合物、芳胺，常用的检测方法有：

（1）直接检测法：该类化合物可以直接用普通GC、LC检测；对于硝基取代芳香化合物，GC-NICI-MS方法具有良好的灵敏度和选择性，LOD可达0.002-0.067ng/g。对于芳胺，LC-MS/MS方法检测时LOQ达 1-10mg/kg，回收率88-116%^[3]；另外，APPI技术也适用于硝基多环芳烃的检测。值得注意的是，该类化合物的诸多报道见于环境监测领域，前期调研时可以多加关注。

（2）衍生法：对于芳胺，可以用氯甲酸己酯与芳胺反应引入己基亲酯链以增强液相保留^[4]；丹磺酰氯与胺类反应也可以改善保留及液相质谱响应；用五氟苯甲醛将废水中的苯胺类化合物进行衍生后用GC-MS检测等。

三：举例分析

某原料药项目起始物料之一为硝基取代芳香化合物，但Ames 试验为阴性；其在中间体X中副产物B同样属于硝基取代芳香化合物（但与原料药结构无关），同时无致突变致癌数据。因而该副产物归为3类：有与原料药结构无关的警示结构，无致突变性数据。该原料药属于长期用药，遂归为“7.1：基于TCC的可接受摄入量（针对治疗大于10年，且无致癌性数据的2、3类）”。再根据计算出限度，本例中限度为5ppm。因而需要制定研究策略，保守起见依照表2中方法2：在起始物料、中间体和原料中对杂质检测，或过程控制，用合适方法将标准设定在可接受限度内。适当情况下，更优选择为方法3：即工艺清除理论研究和分析检测的结合。Andrew Teasdale等人指出杂质的总理论清除因子OTPF/要求的清除因子RPF大于100时，则不需进行测试或进行半定量清除因子风险说明[5]。
根据中间体X的溶解性、副产物B的结构特征（含2个羟基、不属于挥发性物质、含有紫外吸收基团）及所需达到的限度标准，综合考虑采用40%甲醇-水作为稀释剂，采用5mM乙酸铵-乙腈作为流动相、LC-MS（ESI-）进行分析。定量限达到限度浓度水平的20%，线性、重复性、准确度等验证指标符合要求。

四：参考文献

[1] Romualdo Benigni et al.Structure alerts for carcinogenicity, and the Salmonella assay system: A novel insight through the chemical relational databases technology. ，Mutation Res,2008.

[2]马磊，马玉楠，等.遗传毒性杂质的警示结构。中国新药杂质2016.

[3] Patrick Kämpfera,Stéphanie Crettaz,et al. Quantitative determination of 58 aromatic amines and positionalisomers in textiles by high-performance liquid chromatography withelectrospray ionization tandem mass spectrometryPatrick. Journal of Chromatography A 2019.

[4] David Q. Liu∗, Mingjiang Sun, Alireza S. Kord.Recent advances in trace analysis of pharmaceutical genotoxic impurities,2009.

[5] Andrew Teasdale et al.Risk Assessment of Genotoxic Impurities in New Chemical Entities:Strategies To Demonstrate Control.Org. Process Res. Dev. 2013.